教你用熒光定量PCR儀（ABI 7500）

打開電腦及儀器電源，雙擊電腦桌面上的7500 software圖標打開程序。

圖片來源：網絡

軟件主界面：

圖片來源：7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE

實驗設置：

a.實驗名稱

b.儀器型號

c.實驗目的：定量、Genotyping(基因分型)、定性（有/無）

d.定量類型：標準曲線、相對標準曲線、相對定量

e.實驗方法：探針法、染料法

f.模板類型：gDNA、cDNA

g.Target設置：Target包括目的基因、內參基因（多少個和名稱）。

探針法需要選擇使用的熒光基團和淬滅基團。

h.標準曲線設定：幾個點、每點幾個重復、定義標準量范圍。

圖片來源：qPCR進階攻略——帶你玩轉qPCR儀器設置！-Yeasen

i.樣本設置：Sample包括實驗組、對照組、負對照組；樣本數、每樣本重復數、陰性對照數、樣本選擇和命名。

j.反應孔的設置：根據樣品的排布選中面板上的加樣孔，勾選左邊對應的目的基因及模板。

注意：不應為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample，這樣排布會造成比較大的風險。我們通過下面的例子進行說明：

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我們同一塊板上同時擴增兩個基因，而布孔時選成同一個Target，那么儀器默認的都是同一個閾值，假如布孔時都選成Target1，紅色這條閾值線對于Target1是合理的，但對于Target2則不合理，因為這時已經不在指數擴增期，得到的Ct值并不可信。

反應程序設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的Master Mix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分鐘）。

a.反應體系設置：

反應體系的配制，不得不說到參比／校正染料（reference dye，passive dye）。常用的是ROX或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。

參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROX配制在MasterMix或者Premixture里，也有的是單獨分開。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROX染料校正。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要。

需要注意一點ABI儀器的需要加ROX參比染料的，默認的是ROX，要根據不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。如BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none"。

b.兩步法或三步法：qPCR反應可以將退火與延伸兩步進行合并，條件需要根據引物和目的基因的長度進行調整，根據qPCR引物設計原則，引物的Tm值在60℃左右，因此這一步的溫度一般可設為60℃。

c.熒光信號采集：對于染料法而言，兩步法檢測的熒光信號采集應該在退火延伸的整合步驟；三步法應當在72℃延伸時采集，此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態；Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。以ABI 7500為例，選擇在哪一步采集熒光信號點亮其下面的小方塊即可。

d.熔解程序：使用染料法進行熒光定量PCR時，我們通常會在擴增階段完成后進行熔解曲線分析，幫助確定產物類型，判斷是否有非特異性擴增的產生。

以SYBR Green法為例，SYBR Green染料只有結合到雙鏈DNA的小溝中才能發出熒光，擴增反應完成后，對產物逐漸升溫同時監測每一步的熒光信號，隨著溫度升高，DNA雙鏈解開，產物熒光信號下降。

溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。溫度一般設置在60℃-95℃區間，能包含產物Tm值和非特異產物Tm值即可。在某個溫度下，雙鏈DNA會解鏈一半，此后剩下的一半會迅速解鏈，熒光驟降并形成變化的拐點，這個溫度稱為退火溫度（Tm值）。將溫度與熒光強度的變化求導作圖(-dI/dT)，從而生成熔解曲線。

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RUN：全部設置好之后，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！

數據分析：

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